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内皮原代细胞的提取步骤及注意事项

发布时间:2020-11-13浏览:64次
  内皮原代细胞培养,也称为初代培养,是指从供体获得组织细胞后,在体外进行的一次培养。采用了组织块培养、消化培养、器官培养和悬浮细胞培养等方法。
  
  直观地看,原代细胞就是不能无限传代,无论你是自取细胞还是从试剂公司买来的细胞,都会建议你在P2-P3代完成实验。但众所周知,P2-P3代细胞的数量难以满足细胞试验对细胞的需求。因此,掌握提取和培养原代细胞的技术,使细胞尽可能保持在良好的状态中几代,对于实验成败至关重要。
  
  内皮原代细胞的提取步骤及注意事项:
  
  1、整个操作在通风良好的超净台下进行,所有设备都要经过高压消毒。
  
  2、根据BALB/c小鼠的体重,以10ml/kg浓度3%C11H17N2NaO3给其麻醉;将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯中,这个步骤不仅可以消毒,还可以使小鼠的体毛浸湿,并且在随后剃去毛发时不会沾到剪刀或组织。
  
  3、用镊子轻轻夹起老鼠的心脏,将装有PBS的注射器插入心尖,同时在右心耳处剪下一个小口,缓慢推入注射器,当心脏跳动时,冲洗出体内的血液。
  
  4、取小鼠肺组织,将其切成米粒样大小,在预冷的HBSS中反复冲洗数次。
  
  5、把小米粒大小的肺组织放入培养瓶中(培养瓶前天用1%明胶溶液包裹培养面,,小鼠处理前,将培养瓶放入培养箱内,温度降到37度),放入培养箱内37度,消化4小时。
  
  6、在消化4小时后,加入RPMI1640培养基(10%血清,1%双抗,1%内皮细胞生长因子)10ml(在正常培养条件下,初次加入培养基的量为2倍),继续培养24小时(可根据细胞贴壁情况适当调整继续培养时间)。
  
  7、24小时后,取肺组织,镜下观察细胞状况,进行换液。内皮原代细胞的提取和培养是非常缓慢的过程,一般要等到24小时后,才能在镜面上看到少量的细胞群,一周到两周后才能看到卵石状排列。
  
  8、内皮原代细胞在2-3天内换液一次,因内皮细胞生长形成单层时,会出现接触抑制现象。因此,内皮细胞的生长接近单层的时候就可以传代,不要等到细胞长的很满。