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原代细胞消化-胶原酶应用

发布时间:2021-05-07浏览:113次

                 胶原酶胶原蛋白水解酶

一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清(或BSA)的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,zui终浓度200u/mL  此酶消化作用缓和,无需机械振荡

市面卖的胶原酶一般是100mg一瓶,可以直接加100mlPBS或DMEM基础培养基(更佳)配置,浓度即为0.1%。消化大量组织,应提高浓度到0.2% 0.3%,再添加少量BSA或FBS(提高细胞活性)。

它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构,而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质,因此,这对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感,极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。

胶原酶(collagenase)是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的,主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬,内含较多结缔组织或胶原成分时,用胰蛋白酶解离细胞的效果较差,这时可采用胶原酶解离细胞法。 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织,可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为zui终浓度200U/ml。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶,要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。

胶原酶I型 : 含有比较均匀的各种酶活力(包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性), 主要用于上皮、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的分离。

胶原酶II型 : 含有更高的梭菌蛋白酶活性,适用于肝脏,骨,肾,甲状腺,心脏和唾液腺组织细胞的分离,更适合消化间质细胞。

胶原酶 III型: 含有较低的蛋白酶活性,常用于乳腺细胞的制备。

胶原酶IV型 :含有低胰酶活性,通常用于胰岛细胞的制备,或者需要维持受体完整性的细胞制备实验。

胶原酶V型 :可用于胰腺小岛组织的分离,结缔组织分离。

组织量:酶液=1:3左右

三,中性蛋白酶

中性蛋白酶只水解由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水大分子氨基酸提供氨基的肽键。对不同氨基酸构成的肽键的水解能力,因酶的来源而异,大体是亮氨酸>苯丙氨酸>酪氨酸。

  • 弹性蛋白酶,由动物的胰脏用水提取而得,也可用细菌的培养液在低温下用水提取而得。

弹性蛋白酶 可使结缔组织蛋白质中的弹性蛋白消化分解,包括肽键结合的、酰胺结合的和酯结合的进行加水分解。作用的最适pH值7.8,最适作用温度25℃。

 

胰蛋白酶应用广泛,特异性也差,一般用在间质少的细胞组织; 中性蛋白酶作用相对特异性,在皮肤,肠道,胃这里用的多点,比胰蛋白酶也要温和点,常与胶原酶混合消化。

以皮肤为例,胰蛋白酶既破坏桥粒也破坏半桥粒,其作用部位是基底层细胞和其上的棘层细胞,而中性蛋白酶只破坏半桥粒,不影响表皮细胞之间的连接,作用部位在基底膜Iv型胶原和纤维粘连蛋白。

对于比较难消化的组织,可以混合酶一起用。比如:胰酶和胶原酶一起用,胶原酶和弹性蛋白酶一起用。也可以先用胶原酶消化,再用胰酶短时间消化获得目的细胞。