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想要实现大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养,必须完成这些步骤

发布时间:2021-03-17浏览:166次
  大鼠卵巢颗粒细胞分离自PMSG诱导后3天的大鼠的卵巢组织,颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞,其增殖与分化直接影响着卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动。细胞形状呈圆形或椭圆形。
  
  大鼠卵巢颗粒细胞原代分离培养:
  
  1、材料准备:取21-25天雌性SD大鼠,每日皮下注射PMSG40IU,48H后颈椎脱臼法处死。将大鼠置于75%乙醇中浸泡消毒灭菌。
  
  2、取材:在无菌条件下迅速剖取卵巢放入预冷的PBS中,除卵巢周围的组织及表面包膜。含双抗的PBS多次洗涤后置于预冷的DMEM-F12培养基中。在解剖显微镜下用1ml注射器针头刺破卵泡,使大鼠卵巢颗粒细胞释放进入DMEM-F12培养基,离心管内吹打分散成单个悬浮细胞。800r/min离心5min,去除上清。
  
  3、消化:加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA1ml,重悬细胞,于37℃,5%CO2培养箱中消化60min,期间从培养箱取出用吸管反复吹打悬液2-3次,直至组织消化为黏液状、颗粒细胞团块分离即可,加入含10%胎牛血清的培养液以1:1比例终止消化,200目不锈钢细胞筛过滤。
  
  4、离心:收集过筛细胞液,800r/min离心5min,加PBS洗涤滤液弃上清,收集细胞。
  
  5、接种:加DMEM-F12完全培养基至离心后疏散的细胞团中,重悬细胞,制成单细胞悬液。台盼蓝染色,计数。将细胞稀释成浓度为3.0×105ml的细胞悬液,接种于六孔板中,在37℃,5%CO2培养箱中预培养48H后换液1次,去除未贴壁细胞,此后隔日换液1次。
  
  大鼠卵巢颗粒细胞注意事项:
  
  1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
  
  2、在细胞培养过程中,请注意保持无菌操作。
  
  3、传代培养过程中,胰酶消化时间不宜过长,否则会影响细胞贴壁及其生长状态。